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食品与生物工程学院
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何华纲博士课题组:广谱抗白粉病基因Pm21的图位克隆与功能验证

 

小麦白粉病是危害小麦生产的主要病害之一。簇毛麦Pm21基因具有广谱、高效的小麦白粉病抗性,自1995年正式公布Pm21基因以来,携带Pm21基因的小麦品种在生产上得到广泛应用。然而,由于携带Pm21基因的外源染色体6VS与小麦部分同源染色体不重组等因素的限制,Pm21基因的图位克隆研究长期未能取得突破。

2012年以来,何华纲课题组与江苏省里下河地区农业科学研究所别同德博士课题组开展紧密合作,发现了感白粉病二倍体簇毛麦种质资源,实现了Pm21基因的精细遗传定位,进而克隆了三个具有典型CC-NBS-LRR结构的抗病基因类似物(RGA),通过病毒诱导的基因沉默、大规模人工诱变和转基因功能分析,证实候选基因DvRGA2就是Pm21基因。簇毛麦Pm21基因的图位克隆及功能验证的完成,为揭示Pm21基因的抗病分子机制奠定了基础。

 

1、感白粉病簇毛麦的发现与Pm21基因的精细定位
 
从国外机构收集了100多份簇毛麦材料,对其幼苗进行白粉病抗性鉴定,获得了4份感白粉病材料(DvSus-1 ~ DvSus-4),利用抗病系DvRes-1和感病系DvSus-1构建了F2作图群体(10536个单株),进行遗传作图,将Pm21基因定位于分子标记6VS-08.4b6VS-10b界定的0.01 cM的区间内(图1A)。

 

 

2、抗病基因类似物(RGA)基因的克隆
 
通过比较基因组作图发现,小麦和二穗短柄草的同源区段存在一个保守RGA位点(图1B1C)。利用PCR技术,克隆了三个具有较高序列同源性的RGADvRGA1 ~DvRGA3)(图2),遗传分析表明这三个RGA均与Pm21基因共分离。其中,DvRGA1DvRGA2受白粉菌诱导而增强表达,DvRGA3无转录产物

 

3 病毒诱导的基因沉默分析
 
病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)分析表明,DvRGA2基因的沉默可导致白粉菌高度发展,并出现肉眼可见孢子堆,而DvRGA1基因的沉默不能促进菌丝发展(图3A3B)。

 

4、大规模人工诱变分析

对扬麦18(携Pm21)进行EMS诱变,从6408M2家系中筛选到58个独立的突变体,全生育期均高感白粉病(图3C)。除Y18-S16涉及Pm21位点的缺失,其余57个突变体中的DvRGA2都发生了点突变(图3D),随机选择11个突变体对DvRGA2两侧的基因DvPP2CDvRGA1进行测序,均无突变位点。


 5
、转基因功能验证
BSMV-VIGS和突变分析都表明,候选基因DvRGA2Pm21基因介导的抗性的必需基因。为了进一步验证DvRGA2Pm21的同一性,我们将具有天然启动子的DvRGA2转化感病受体科农199,获得16个独立的T1株系,其中6个株系中检测到外源基因。采用强毒性白粉菌小种Bgt ZY01和采集自不同地区的混合菌种进行鉴定,6个转基因株系均对白粉病免疫(图3E)。由此证实DvRGA2就是Pm21基因

致谢:
本研究得到以下项目支持:江苏省自然科学基金项目(BK20130503):簇毛麦抗病基因类似物DvRGA1DvRGA2的功能鉴定(2013-2016,已结题);国家自然科学基金项目(31471497):小麦-簇毛麦易位染色体库构建及重要农艺基因发掘(2015-2018,在研)。感谢GRINIPK等国际种质资源机构提供簇毛麦材料。

 

录入时间: 2017-08-11   〖返回〗   〖收藏〗 查看次数:     
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